可调焦距的透镜可加速和zeng强多种现代显微镜要领（包罗共聚焦、双光子和光片显微镜）的三维成像能力。

显微镜初学者可能会感应疑心，由于他们注重到样本中仅略微失焦的部门在图像中看起来wangwang要：枚唷Ｈ搜劭吹降木吧钏坪醣认嗷吹降木吧畲蟮枚。这种令人疑心的效果之以是发生，是由于眼睛会顺应：通过显微镜视察时，用户会一直（通常是无意识地）移动焦平面，而无需触摸调焦旋钮，只需将目镜调整到差异的焦距即可。因此，自从显微镜发现以来，可调透镜就资助研究人yuan更直观地感受到微观物体的三维形状和纹理。在具有电子图像收罗功效的现代显微镜中实现类似的装置是非？扇〉。现在，科学家越来越需要在越来越短的时间尺度上以高空间分辨率对生物体的结构和功效举行成像。现代生物显微镜也正逐步从对载玻片和盖玻片之间的扁平小样本举行成像转向 3D 细胞作育、整个胚胎甚至动物体内成像，以研究更自然的情形中的生长和心理学。

传统上，获取 3D 图像数据需要使用载物台或压电物镜 Z 扫描仪对物镜或样本举行机械平移。由于此类装备中运动部件的机械惯性，要实现数百微米 Z 规模 10 到 20 Hz 以上的体积扫描速率很是具有挑战性。

另一种称为“远程聚焦”的解决方案涉及改变光进入或脱离显微镜物镜时的会聚度，以划分引起引发或发射焦点的轴向偏移。所有类型的可调光学元件都可以用于此目的：例如空间光调制器、可变形镜和可调焦距透镜。可调焦距透镜成本低、结构和控制简朴、焦距调治规模广，特殊适合要求以中中分辨率举行快速体积采样的显微镜应用。

可调焦距透镜手艺

Optotune 的可变焦透镜接纳弹性聚合物质料。透镜的焦点元件由一个薄膜组成，gai薄膜在充满液体的腔室和空气之间建设界面（图 1）。为了调整焦距，音圈致动器对围绕透镜通光孔径的液体容器施加压力。因此，液体被迫进入透镜的中心，从而改变膜的曲率。控制电可调透镜 (ETL) 很简朴，只需要一个现成的电流控制器或透镜驱动器为透镜提供 0 至 290 mA 之间的电流。

图 1. ( a、b )：电动可调镜头 (ETL) 的事情原理。电流控制的电磁或机械致动器向下推充满液体的镜头容器，迫使镜头液体进入镜头中心并改变其形状。( c ) 对于 ETL，不朽qing缘mg提供了一个软件控制的镜头驱动器 ( d )，用于提供电流。( e ) ETL 的典型响应时间约为 5 毫秒。现实稳固时间随镜头光圈而转变。

有种种各样的 ETL 可供选择，其光圈规模从 6mm到 16mm。对于高色散镜头液体版本，典型的焦距规模为 52 至 120 mm，而对于低色散镜头液体版本，典型的焦距规模为 80 至 200mm。在事情历程中，控制电流会使镜头升温，导致温度相关的焦点漂移。由于液体镜头的热焦距膨胀比玻璃镜头的热焦距膨胀约莫大两个数目级，因此镜头需要集成温度传感器。团结靠近液体的温度传感器以及镜头上校准曲线的存储，USB 驱动法式固件可以盘算出准确的电流值，以设置和维持镜头在给定的焦距。ETL的一大优势是响应时间短，只有几毫秒。图 1e 显示了响应矩形阶跃脉冲时归一化屈光度随时间转变的典型示例。可调透镜在 240 至 2500 nm 规模内具有较大的透射率和较高的损伤阈值（1064 nm 一连波操作下的损伤阈值为 10 kW/cm2），而且具有保偏功效。

将可调透镜集成到显微镜中

现代显微镜使用无限远校正物镜，这意味着源自样品的光会以平行光束的形式从物镜中射出。要建设图像，需要一个特另外筒镜（图 2）。相反，通过将准直激光束发送到物镜中，激光会集中到样品内部的焦点上。使用可调透镜改变光束的准直状态会移动焦平面。例如，当将发散光束发送到物镜时，焦点会移离其前透镜。

图 2. ( a ) 在具有无限远校正光学系统的显微镜中，图像由物镜和筒镜形成。( b ) 通过在物镜和筒镜之间插入由两个消色差透镜组成的附加中继系统，形成共轭光瞳。ETL 和偏置透镜可以放置在此位置以举行轴向聚焦，而无需改变数值孔径或放大倍数。水平放置 ETL 和偏置透镜可阻止重力引起的透镜膜变形。

对于大多数 3D 显微镜应用，需要能够zeng加和镌汰物镜的事情距离。一些 ETL 仅限于在正焦距极限之间举行调整。在这种qing况下，需要将它们与牢靠负偏移透镜 (OL) 配对，以将光束从会聚变为发散。当通过显微镜的目镜视察时，人类视察者会移动头部，直到他们的眼睛位于显微镜的出瞳处，通？杉坪跣Ｔ谀烤瞪戏降男×僚獭５狈胖迷诔鐾κ，眼睛可以最好地概览微观图像，而且作为“集成”的人类聚焦装置施展最佳作用。理想qing况下，ETL/OL 组合也放置在这样的瞳孔位置，但使用尺度目镜的出瞳通常没有利益：典型的筒透镜和目镜组合的高中置放大倍数极大地限制了可用的聚焦规模。这是由于调整规模与显微镜放大倍数的平方成反比。更好的选择是使用定制的中继系统建设与显微镜物镜共轭的瞳孔位置（图 2）。需要小心地将 ETL/OL 组件放置在光路的垂直部门（图 2b）。否则，由于重力引起的透镜膜变形，图像可能会泛起不须要的像差（尤其是彗形像差）。在具有高度？榛杓频男乱淮芯肯晕⒕抵，集成这种中继系统通：芗蚱。只管云云，一些商用仪器不应gai由用户举行大量修改。在这种qing况下，ETL/OL 组合可以放置在平行光束路径上的其他位置。弱点是将可调元件放置在远离共轭瞳孔的位置会导致聚焦时放大倍数和数值孔径 (NA) 发生转变。用光学设计术语来说，gai系统不再是远心的。因此，焦距偏移陪同着变焦效果和分辨率转变。对于小的调谐规模 - 几十分之一微米 - 这些影响通常很是小且可以容忍。对于较大的焦点位移，可以通过图像处置赏罚来赔偿放大倍数的转变。

图 3.使用 40 倍物镜和集成在转盘共聚焦显微镜中的 ETL 拍摄的花粉粒（直径 100 μm）的 Z 轴堆叠图。图中显示了差异轴向焦点位置的单帧图像和最大强度投影。最大 Z 轴规模为 60μm。

在远程聚焦系统的设计中，成本和重大性之间存在着主要的权衡。与可变形镜或空间光调制器差异，大多数可调透镜只有一个自由度，即焦距。在远程聚焦路径中配备单个 ETL 的显微镜无法像真正的自顺应光学显微镜那样在 Z 调谐规模内执行同样重大的像差校正。可是，使用 ETL 聚焦的成本仅为成熟自顺应光学装置成本的一小部门。

应用示例：共聚焦显微镜

共聚焦显微镜是最主要的显微镜手艺之一，它在细胞生物学、单分子物理学和许多其他学科中有着普遍的应用。不朽qing缘mg测试了 ETL 与毗连到倒置显微镜支架（Olympus IX71）的商用转盘共聚焦显微镜？椋╕okogawa CSU-X1）的组合。

由于无法在gai显微镜中集成中继系统，因此将 ETL/OL 组件安装在可旋转到光路中的定制滤光块中。使用 40 倍物镜和 1.3 NA（Olympus UPLFLN 40XO），最大 Z 规模到达 60 ?m。

应用示例：体内双光子显微镜

由于在散射介质中具有精彩的成像能力，双光子引发是一种很是适合对脑组织深处举行荧光成像的手艺。团结神经元运动的功效指标和体内成像协议，双光子显微镜是一种尺度要领，用于纪录活体小鼠脑内数百微米深处的十分之一到数百个神经元的群体运动。

对单个焦平面的采样只能提供局部网络中漫衍运动模式的一瞥。因此，不朽qing缘mg修改了现有的双光子显微镜，gai显微镜能够使用带有 ETL 和 OL 的声光偏转器举行很是快速的 X/Y 扫描。1声光偏转器可以以千赫兹的速率以随时机见模式快速将飞秒激光束瞄准大量神经元。

添加 ETL 可以快速瞄准多个焦平面。不朽qing缘mg实现了 30 到 40 Hz 的成像速率，最多可对 40 个神经元举行成像，这些神经元漫衍在相距 30 到 100 ?m 的两个平面上（图 4）。除了多平面成像外，ETL 还可用于对苏醒和行为动物举行运动校正。

图 4. ( a ) 物镜支架，用于将 ETL 集成到带有声光偏转器的定制双光子显微镜中，襶uan愣孕∈蟠竽灾械纳窬硕傩刑迥诔上。ETL 由电流控制器 (CC) 驱动，并与偏置透镜（未显示）组合安装在靠近物镜的位置。( b ) 由于 ETL 未放置在共轭瞳孔位置，因此扫描体积呈锥形。声光偏转显微镜可以使用钙指示剂以随时机见扫描模式快速丈量神经元运动。ETL zeng加了以高达 40 Hz 的速率对多个平面举行成像的能力。( c ) 这些图像显示了差异深度的两个平面（神经元显示为灰色，星形胶质细胞显示为橙色）。选择用于快速钙成像的细胞（1 到 40）已标志。神经元信号体现出对施加在动物髯毛上的重复气流的刺激锁定反映。比例尺：20 ?m。

应用示例：快速3D光片显微镜

在已往十年中，光片显微镜和选择性平面照显着微镜 (SPIM) 已被公以为生物样本体内成像的理想工具（例如，用于纪录斑马鱼和果蝇的胚胎发育）。在 SPIM 中，样品从侧面用光片照射，以将荧光引发限制在显微镜物镜焦点的单个平面上。SPIM 提供精彩的光学切片、低光毒性和高图像收罗速率，并被《自然要领》评为 2014年度要领。

图 5.使用配备 ETL 的快速 Z 扫描 (ETL-SPIM) 光片显微镜以 60 Hz 体积速率对跳动的斑马鱼心脏举行 3D 重修。心脏标志为蓝色；红细胞显示为红色。

最近，SPIM 装置配备了 ETL，可举行快速体积扫描。使用以每秒数百到数千帧的速率运行的相机，可以以每秒 30 到 60 ci体积扫描的空前速率获取跳动斑马鱼心脏内的 10 到 20 个平面。4云云高的体积率可以追踪流经跳动心脏的单个红细胞。

未来

未来，将提供具有更大通光孔径和调谐规模的 ETL，以及可使重复性提高一个数目级的创新驱动电子装备。还可以想象，带有集成可调镜头的显微镜物镜将在未来十年内投入通例使用。

熟悉作者

Fabian F. Voigt 是瑞士苏黎世大学脑研究所的博士生

致谢

作者谢谢 Manuel Aschwanden、Jerry Chen、Adriana Dabacan、Helge Ewers、Florian Fahrbach、Benjamin Grewe、Fritjof Helmchen、Jan Huisken、Michaela Mickoleit、Oliver Pf?ffli 和 Mark Ventura 为实现基于 ETL 的快速 3-D 显微镜所做的孝顺。

参考文献

1. B. Grewe 等人 (2011)。使用电动可调焦距透镜对神经元细胞群举行快速双层双光子成像。Biomed Opt Express，第 2035-2043 页。

2. J. Chen 等人 (2013)。使用可调焦透镜举行双光子成像时代在线校正舔舐引起的大脑运动。J Physiol，第 4689-4698 页。

3. EHK Stelzer (2015)。用于定量生物学的光片荧鲜明微镜。Nat Methods，第 12 卷，第 1 期，第 23-26 页。4

4. F. Fahrbach 等人（2013 年）。带可调透镜的快速 3-D 光片显微镜。Opt Express，第 21010-21026 页。5

5. M. Mickoleit 等人（2014 年）。高分辨率重修跳动的斑马鱼心脏。Nat Methods，第 11 卷，第 9 期，第 919-922 页。